Caracterización de biodiversidad de microorganismos en agua, suelo y sedimentos para evaluación del riesgo ambiental por derrame de petróleo

María Claudia González1, Maria Claudia González1, Mailyn Gonzalez1, Paola Montoya1, Nicolás Franco1, Eduardo Tovar2, Adan Ramirez3

1 Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt, Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Colombia; 2 Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander Von Humboldt, CIAT Km. 17 Carretera Cali, Palmira, Colombia; 3 Corporación CorpoGen, Carrera 4 # 20-41 - Bogotá, Bogotá, D.C., Colombia

Corresponding author(s): María Claudia González (mgonzalez@humboldt.otg.co), Maria Claudia González (mgonzalez@humboldt.org.co)

Received {date}; Revised {date}; Accepted {date}; Published {date}

Citation: Combination of authors, year of data paper publication (in parentheses), Title, Journal Name, Volume, Issue number (in parentheses), and doi of the data paper.

Resource Citation

Corpogen, Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt (2020).Caracterización de biodiversidad de microorganismos en agua, suelo y sedimentos para evaluación del riesgo ambiental por derrame de petróleo. 190 eventos. http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_gta_2020 http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_gta_2020

Abstract

I2D-BIO_2020_018. Realizar la caracterización genética, a través de metabarcoding, en zonas que han tenido exposición a derrames de petróleo  y evaluar los efectos de la presencia de hidrocarburos en las comunidades microbianas. El metabarcoding es un método que permite caracterizar la biodiversidad en una muestra ambiental (i.e. polen, agua, suelo, hojarasca) mediante la secuenciación masiva de marcadores genéticos estandarizados, se ha usado ampliamente para estudiar la diversidad en ecosistemas terrestres y acuáticos, las abundancias y alteraciones a la estructura de la comunidades. En esta técnica, la identificación es hecha a partir de bases de datos de referencia, en la cual se compara los resultados obtenidos con varios repositorios para obtener una identificación aproximada de las secuencias genéticas de especies que componen cada comunidad. Para estimar la biodiversidad a través de metabarcoding en estos ambientes con exposición a petróles, se realizó la extracción, amplificación y secuenciación de muestras de suelo, agua y sedimentos en diferentes cuerpos de agua a lo largo de la vía Puerto Vega-Teteyé (Puerto Asís - Putumayo), para bacterias se empleó el marcador 16S y para hongos ITS. En total se incluyeron 39 puntos de muestreo, que contienen 117 Bacterias y 117 muestras de hongos que corresponden a secuencias genéticas por grupo biológico. Se incluyeron además 4 controles positivos, 4 controles negativos, 12 controles de extracción y amplificación, y 53 blancos. Las secuencias ancladas a estos metadatos, no cuentan con ningún tipo de procesamiento bioinformático y para su uso es necesario realizar todos los filtros y la depuración pertinente para datos generados por metabarcoding.

Keywords: otro, metabatcoding, bacterias, hongos, derrame de petróleo, agua, suelos, sedimentos

General description

Purpose: El objetivo de este proyecto es realizar la caracterización de bacterias y hongos a través de metabarcoding, en muestras ambientales de agua, suelo y sedimentos, tomadas en un área petrolera donde se han reportado derrames de petróleo desde 2005. Las muestras se tomaron a lo largo del corredor víal Puerto Vega-Teteyé (Puerto Asís/Putumato). Se busca generar una la línea base que permita analizar el impacto de las perturbaciones actuales, a partir de la cual se pueda realizar monitoreo a futuro.

Project details

Project title: Diseño e implementación de un programa de monitoreo para evaluar el estado de la biodiversidad presente en las áreas afectadas por derrames de hidrocarburos generados por terceros y por eventos operacionales en el corredor vial puerto vega – teteyé – bloque suroriente y el efecto del programa de limpieza y recuperación realizado por la empresa gran tierra energy
Personnel: Juliana Agudelo
Funding: La financiación se enmarca en la Orden de Servicio No. 19-160, que tiene como objeto "Implementar un programa de monitoreo que permita conocer el estado actual de la biodiversidad presente en las áreas afectadas por derrames de hidrocarburos generados por terceros y por eventos operacionales en el corredor vial Puerto Vega-Teteyé -Bloque Suroriente". Las secuencias genétcias las generó la Corporación CorpoGen mediante el contrato No. 19-19-160-245PS que tiene como objeto "prestar los servicios para la construcción de librerías, y secuenciación para bacterias y hongos de las extracciones de ADN ambiental para metabarcoding, usando tecnología de secuenciación masiva de alto rendimiento, de muestras de suelo, agua y sedimento"
Study area descriptions/descriptor: El área delimitada por Gran Tierra Energy para el desarrollo del programa de monitoreo en el proceso de limpieza y recuperación de áreas afectadas por emergencias ambientales generadas por terceros y eventos operacionales en el corredor vial Puerto Vega – Teteyé (Bloque Suroriente) se localiza en el Departamento de Putumayo, entre los ríos Putumayo y San Miguel, en jurisdicción de CORPOAMAZONIA.
Design description: El programa tiene como objetivo la implementación de un programa de monitoreo que permita conocer el estado actual de componentes claves de la biodiversidad y el cambio que estos presenten, posterior a la implementación de las acciones de limpieza ejecutadas en las áreas afectadas por derrames de crudo en el corredor vial Puerto Vega – Teteyé – Bloque Suroriente. a partir de la caracterización genética, a través de metabarcoding, de las comunidades microbianas de hongos (ITS) y bacterias (16s) en muestras de agua, suelos y sedimentos en 39 sitios escogidos por GTE.

Data published through GBIF: http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_gta_2020

Taxonomic coverage

General taxonomic coverage description: La generación de datos se enfocó en los grupos biológicos de bacterias y hongos. Se reportó un total de 117 registros que corresponden a secuencias genéticas de hongos y 117 de bacterias (Bacteria). El nivel taxonómico alcanzado dentro de cada grupo biológico es dependiente de la resolución y de cuán completas se encuentren las bases de referencia usadas. Los archivos asociados no se encuentran depurados ni cuentan con alguna asignación taxonómica, por lo que no es posible determinar que taxones de cada grupos se encuentran ni el número de secuencias encontrados en cada uno.
Taxonomic ranks
Domain: Bacteria
Kingdom: Fungi
Common names: Bacteria, Hongo

Spatial coverage

General spatial coverage: Las muestras se tomaron en el corredor de Puerto Vega - Teteyé, en el Municpio de Puerto Asís, Departamento del Putumayo, en área de influencia de un proyecto petrolero de la empresa Gran Tierra Energy.
Coordinates: 0°16'44.4''N and 0°24'3.6''N Latitude; 76°33'18''W and 76°27'28.8''W Longitude 

Temporal coverage: October 1, 2019 - October 11, 2019

Methods

Method step description: 1. Selección de puntos de muestreo dentro de cada localidad. 3. Toma de muestra: registro de datos del punto de muestreo, delimitación de parcela de 16 m² y toma de 16 submuestras. Toma de muestras de agua y sedimentos. 4. Homogenización de la muestra de suelo. Separación de tres sub-muestras (réplica biológica) de 15 gr. cada una. 5. Extracción de ADN de las muestras y controles de extracción, usando buffer fosfato y protocolo modificado a partir de Zinger et al. 2016, Taberlet et al. 2012 y fabricante de kit de extracción (NucleoSpin Soil, Macherey-Nagel). 6. Construcción de controles positivos a partir de comunidades de hongos y bacterias de muestras provenientes de zonas diferentes a las del proyecto. 7. Amplificación de los marcadores 16s (bacterias) e ITS (hongos) para cada una de las muestras. Se realizaron tres réplicas de PCR por muestras. Se incluyeron controles negativos de PCR. 8. Etiquetado y multiplexación de muestras. 9. Construcción librerías Illumina. 10. Secuenciación 11. Demultiplexación (asignación de secuencias a muestra) de secuencias obtenidas, usando la función ngsfilter encontrada en ObiTools (Boyer et al. 2016). 12. Ubicación de los archivos: Los datos se encuentran depositados en un disco duro ubicado en el Instituto Alexander von Humboldt. Se encuentran dos carpetas correspondientes a cada grupo biológico: Bacterias y Hongos. En cada carpeta se encuentran alrededor de 238, 117 correspondientes a hongos, 117 a bacterias, nombrados de la siguiente manera a: 1. Tipo de  muestra A:Agua, S:Sedimento, Su:Suelo y 2. Código de sitio de muestreo “BRA-1”. Tanto hongos como bacterias tienen 53 blancos nombrados como "blank",  12 réplicas PCR nombradas como "Control", 4 controles positivos nombrados "Positivo" y 4 controles negativos nombrados "Negativo". Nota 1: La PCR o la secuenciación pueden ser inhibidas. En este caso, lo recomendable es trabajar con las réplicas generadas. Nota 2: Recuerde incluir todas las réplicas de un punto de muestreo al momento de analizar y depurar los datos. Nota 3: Los datos se encuentran depositados temporalmente en un disco duro externo ubicado en el Instituto Alexander von Humboldt.
Study extent description: Las muetras se tomaron en 39 puntos a lo largo del corredor Puerto vega – Teteyé, que corresponde a una franja de territorio del Municipio de Puerto Asís, contigua al límite internacional con la república del Ecuador. El área de estudio incluyó las veredas La Cabaña, La Carmelita, Nuevo Porvenir, Montañita, Cristales, Basilia, Bajo Lorenzó, Buenos Aires, Los Ángeles y Teteyé. Los lugares afectados por los derrames fueron divididos por la empresa Gran Tierra Energy en 13 zonas. En cada una de estas zonas se seleccionaron entre 2 y 4 puntos de muestreo al azar, teniendo en cuenta los lugares en los que habían sido tomadas previamente muestras de sedimentos para evaluar contaminación.
Sampling description: TOMA DE MUESTRAS 1. agua: Se tomaron tres réplicas de muestras de agua en cada uno de los 39 sitios. Cada réplica consistió en la toma de 1L de agua superficial, para lo cual se usaron botellas plásticas de nalgene. Cada réplica se tomó con al menos de 2 metros de distancia a lo largo del cuerpo de agua, idealmente en el centro de los cuerpos de agua, en los casos donde estos eran muy profundos las muestras se tomaban en una de las orillas. Al final para cada uno de los 39 sitios se tomó un total de 3L de agua. 2. sedimentos: Las muestras de sedimentos se tomaron en los mismos puntos donde se tomaron las muestras de agua. Consistía en tomar sedimento a aproximadamente 10 cm de profundidad, cada muestra se guardaba en una bolsa whirl pak (bolsa estéril y hermética).
3. suelo: Las muestras de suelo se recolectaron con una pala de metal de 30 cm de largo. En cada Zona de muestreo se estableció una parcela de 16 m² con 4 transectos de 4 m de largo, separados entre sí por 1 m de distancia. En cada transecto se establecieron 4 puntos a 1 m de distancia donde se recolectaron los muestras de suelo a aproximadamente 10 cm de profundidad. Las 16 muestras de suelo tomadas por punto de muestreo, se mezclaron y homogeneizaron, conformando una sola muestra, posteriormente se tomaron 3 réplicas de 15 gr cada una.
PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. 1. Filtrado de muestras de agua: Con el fin de concentrar las partículas en suspensión en la muestra de agua (1 L), incluido el ADN extracelular, las muestras fueron filtradas usando un sistema para generar vacío. Para esto, se usaron filtros de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0.45 µm. El sistema implementado para la filtración de las muestras incluyó un soporte colector para la fijación de los embudos (manifold), en el cuál tres muestras podrían filtrarse de manera simultánea, un recipiente para el líquido descartado y una bomba de vacío. La filtración del agua se realizó en cantidades que variaron entre 100 a 350 mL por filtro, dependiendo de la cantidad de material particulado presente en la muestra. Debido a esto, para filtrar 1 L de agua de cada muestra, se requirieron entre 3 y 10 filtros. Los filtros usados para cada muestra fueron introducidos en tubos de 50 mL y almacenados en el congelador hasta el momento de la extracción del ADN. Los embudos de policarbonato empleados durante la filtración eran esterilizados por 15 minutos en una solución de hipoclorito al 10% y posteriormente lavados con abundante agua esterilizada, antes de su reutilización. 2. Sedimentos: De cada una de las muestras de sedimentos, se tomaron 15 g en tubos de 50 mL y se conservaron a 4°C. 3. Homogeneización de suelos Cada una de las muestras de suelo fue homogeneizada mezclando el contenido dentro de la misma bolsa por un período de 3 minutos. Luego con espátulas esterilizadas, se tomaron 3 submuestras, cada una de 15 g evitando incluir raíces o rocas y se introdujeron en tubos de 50 mL, que fueron almacenados en nevera a 4°C hasta la extracción de ADN. EXTRACCIÓN DE ADN: Con el fin Con el fin de evitar la degradación de ADN, la extracción se llevó a cabo en las horas subsecuentes a su colecta, para esto se instaló en campo (el hotel) una laboratorio. La extracción del ADN extracelular para los tres tipos de muestras se llevó a cabo utilizando el kit NucleoSpin Soil de la marca Macherey-Nagel, y siguiendo un protocolo modificado e híbrido entre el del fabricante y el propuesto por Taberlet et al. 2012. En total se generaron 356 muestras de ADN, obtenidas de las muestras de agua, suelos y sedimentos.
Quality control description: Para cada jornada de extracción se incluyó una muestra control negativo, la cual consistió únicamente de la solución de Fosfato de Sodio sin muestra, es decir sin ADN, de esta forma, durante los 12 días que tomó procesar todas las muestras, se obtuvieron 12 muestras control. Se incluyeron 4 controles negativos de amplificación y 4 controles positivos (tipo mock community) para las PCR y secuenciación tanto para ITS (hongos) como para 16s (bacterias). Para bacterias, se tomaron DNAs purificados de 6 bacterias, estos se cuantificaron y normalizaron en igual concentración y se preparó una mezcla para emplear posteriormente como control para las PCRs y secuenciación del gen 16S rRNA. Para el control positivo del gen ITS, se emplearon DNAs (obtenidos de proyectos anteriores), y de igual manera, estos se cuantificaron y normalizaron en igual concentración y se preparó una mezcla para emplear posteriormente como control para las PCRs y secuenciación del gen ITS. Se adicionaron blancos (Blank) 53 en las muestras de hongos y 13 para las muestras de bacterias. Las secuencias solo han sido asignadas a sus respectivas muestras y ningún procesamiento bioinformático adicional se ha llevado a cabo, además de este. En caso de ser usadas, deben realizarse el tratamiento con todos los filtros y pasos de depuración que requieren los datos obtenidos de secuenciación masiva de alto rendimiento y metabarcoding. Se resalta que es algunas réplicas pueden no funcionar por diferentes factores técnicos a lo largo de procedimiento. Dada esta situación, contar con varias réplicas por muestra disminuye la probabilidad de perder (no obtener secuencias) la muestra.

Metadata language: Spanish
Date of metadata creation: 2020-08-18
Hierarchy level: Dataset

References
Taberlet, P., E. Coissac, M. Hajibabaei, and L. H. Rieseberg. 2012. Environmental DNA. Molecular Ecology 21:1789–1793.
Zinger, L., Chave, J., Coissac, E., Iribar, A., Louisanna, E., Manzi, S., Schilling, V., Schimann, H., Sommeria-Klein, G., Taberlet, P. (2016). Extracellular DNA extraction is a fast, cheap and reliable alternative for multi-taxa surveys based on soil DNA. Soil Biology & Biochemistry 96: 16-19
Boyer, F., Mercier, C., Bonin, A., Le Bras, Y., Taberlet, P., & Coissac, E. (2016). obitools: A unix‐inspired software package for DNA metabarcoding. Molecular ecology resources, 16(1), 176-182.