Caracterización de biodiversidad en muestras de suelo a partir de metabarcoding

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I2D-BIO_2020_005. Conocer la diversidad de una zona es el paso inicial para tomar decisiones informadas sobre su gestión. Actualmente, los páramos son uno de los ecosistemas más vulnerables debido a la limitada área que ocupan y a la alta presión que sufren por transformación del paisaje como consecuencia de actividades agrícolas, mineras y por cambio climático. Tener un registro de la diversidad presente en los páramos es fundamental para evaluar el impacto de la transformación del ecosistema en la actualidad y en escenarios futuros. Una alternativa a las técnicas tradicionales para realizar inventarios rápidos de diversidad en grupos biológicos como microorganismos o sistemas complejos como los suelos, es el metabarcoding. Esta técnica permite estimar la biodiversidad de sitio dado a partir de una muestra ambiental (p.e. suelo, agua, polen) mediante la secuenciación masiva de regiones cortas y estandarizadas de ADN. Para estimar la biodiversidad a través de metabarcoding en ecosistemas de alta montaña y páramos del departamento de Boyacá, se realizó la extracción, amplificación y secuenciación de muestras de suelo de diferentes coberturas de vegetación para bacterias (16S), hongos (ITS), plantas (trnGH) y otros eucariotas (18S). Como material comparativo se incluyeron muestras de suelo de alta montaña de Cundinamarca y Santander, y tierras bajas de Santander. En total se incluyeron 180 puntos de muestreo, cada uno con tres réplicas biológicas y tres réplicas de PCR. Se incluyeron además controles positivos, negativos de extracción y amplificación, y blancos. En total se reportan 93 eventos de muestreo que contienen 2524 muestras que corresponden a secuencias genéticas por réplica por grupo biológico (Bacteria: 630 registros, Fungi: 629 registros, Plantas: 633 registros y Eukarya: 632 registros). Las secuencias ancladas a estos metadatos, no cuentan con ningún tipo de procesamiento bioinformático y para su uso es necesario realizar todos los filtros y la depuración pertinente para datos generados por metabarcoding.

Resumen
Fecha de publicación Mar 4, 2020
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Registro GBIF No registrado
Palabras Clave
bacterias; hongos; eucariotas; plantas; páramos; alta montaña; gradiente de elevación; coberturas vegetales; otro
Idioma
Idioma de los metadatos Español
Idioma del recurso Español
Contacto del Recurso
NombrePaola Montoya Valencia
PosiciónInvestigadora
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA
Contactopmontoya@humboldt.org.co Tel: 3202767
Creador del Recurso
NombrePaola Montoya Valencia
PosiciónInvestigadora
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA
Contactopmontoya@humboldt.org.co Tel: 3202767
Proveedor de Metadatos
NombrePaola Montoya Valencia
PosiciónInvestigadora
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA, Código postal: 110321
Contactopmontoya@humboldt.org.co Tel: 3202767
Parte Asociada 1
NombrePaola Montoya Valencia
PosiciónInvestigadora
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA
Contacto Tel: 3202767
Rol Usuario
Parte Asociada 2
NombreMailyn Adriana González Herrera
PosiciónInvestigadora
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA, Código postal: 110321
Contactomagonzalez@humboldt.org.co Tel: 3202767
Rol Autor
Parte Asociada 3
Nombre Infraestructura Institucional de Datos
OrganizaciónInstituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt
Dirección Avenida Paseo Bolívar # 16-20, Bogotá, D.C., Bogotá, D.C., COLOMBIA
Contactoi2d@humboldt.org.co Tel: 3202767
Página Webhttp://www.humboldt.org.co
Rol Custodio de los Datos
Cobertura Geográfica
DescripciónLos datos fueron tomados en la cordillera Oriental de Colombia entre los 110 m y 3851 m de elevación. Se tomaron muestras de suelos enfocados en sistemas de alta montaña y páramos del departamento de Boyacá entre los 2298 m y 3851 m de elevación, y se incluyeron muestras de un gradiente de elevación desde los 110 metros de elevación como referencia.
Coordenadas4.239, 7.007 / -74.229, -72.668 (Latitud mínima, máxima / Longitud mínima/máxima)
Cobertura Taxonómica
Descripción La generación de datos se enfocó en cuatro grupos biológicos: bacterias, hongos, plantas y eucariotas. Se reportan 2524 registros que corresponden a secuencias genéticas por réplica por grupo biológico. Específicamente, se reportan 630 registros para bacterias (Bacteria), 629 registros para hongos (Fungi), 633 registros para plantas (Plantae) y 632 registros para Eucariotas (Eukarya). El nivel taxonómico alcanzado dentro de cada grupo biológico es dependiente de la resolución y de cuán completas se encuentren las bases de referencia usadas. Los archivos asociados no se encuentran depurados ni cuentan con alguna asignación taxonómica, por lo que no es posible determinar que taxones de cada grupos se encuentran ni el número de secuencias encontrados en cada uno.
Dominio Bacteria (Bacteria), Eukarya (Eucariotas)
Reino Fungi (Hongos), Plantae (Plantas)
Cobertura Temporal
Fecha inicial / Fecha final2018-02-18 / 2019-02-28
Datos del Proyecto
TítuloAnálisis de la biodiversidad y los servicios ecosistémicos para su aplicación en la toma de decisiones en el departamento de Boyacá
(Personal) Nombre Sandra Patricia Galeano Muñoz
(Personal) Rol Investigador Principal
Fuentes de financiaciónBoyacá BIO. Convenio especial de cooperación No. 17-170 del 2017. Aunar esfuerzos, capacidades y competencias entre el departamento de Boyacá y el Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt para la ejecución del proyecto “Análisis de la biodiversidad y los servicios ecosistémicos para su aplicación en la toma de decisiones en el departamento de Boyacá” en cumplimiento de la meta “Expediciones científicas para inventariar la fauna, flora y microorganismos a nivel taxonómico y genético realizadas, mediante Acuerdo N 055 del 7 de marzo de 2017
Descripción del área de estudioMunicipios del departamento de Boyacá
Métodos de Muestreo
Área de estudioSe visitaron tres las localidades correspondientes a ecosistemas de páramos y alta montaña en el departamento de Boyacá: Páramo El Valle, Páramo El Consuelo y Páramo de Ocetá. En cada localidad se seleccionaron al menos dos puntos de muestreo por cada una de las principales coberturas vegetales identificadas: bosque, matorral mixto y páramo. Los puntos de muestreo se seleccionaron intentando tomar el mayor gradiente altitudinal posible. Como puntos de referencias – comparables – se incluyeron puntos de muestreo ecosistemas de alta montaña y páramos cercanos en la Cordillera Oriental, específicamente en Cundinamarca, Meta y Santander. También se incluyeron puntos de muestreo a lo largo de un gradiente de elevación desde tierras bajas (110 m) hasta páramo (3549 m).
Descripción del muestreoMuestreo en campo: En cada punto de muestreo, se estableció una parcela de 4 m x 4 m, en donde se tomó una muestra de suelo de aproximadamente 10 cm de profundidad por cada metro. Por cada muestra homogenizada, compuesta del suelo recolectado de las 16 sub-muestras, se obtuvieron tres réplicas de 15 gr (réplicas biológicas). Todos los muestreos de suelos se realizaron con palas esterilizadas por flameo, utilizando guantes de nitrilo y tapabocas que fueron cambiados entre cada evento de recolecta. Las muestras se conservaron en seco con sílica gel hasta el momento de la extracción de ADN. Extracción de ADN: Se extrajo el ADN ambiental extracelular de cada muestra siguiendo las recomendaciones de Zinger et al. 2016 y Taberlet et al. 2012. Se utilizó un kit comercial para extracción de ADN ambiental (NucleoSpin Soil; Macherey-Nagel, Düren, Alemania), modificando el paso de lisis, usando un buffer de fosfato para realizar un lavado del ADN extracelular y siguiendo las instrucciones del fabricante. Por cada evento de extracción se incluyó un control negativo que constó de los reactivos usados sin ADN. La diversidad de bacterias, hongos, plantas y eucariotas, fue examinada a través de la técnica molecular de metabarcoding, usando los marcadores moleculares 16S (regionV3-V4), ITS, trnGH y 18S, respectivamente. Se realizaron tres amplificaciones por muestra (tres réplicas de PCR) para los cuatro marcadores mencionados. Por cada evento de amplificación, se incluyó un control negativo de PCR. Se realizó la construcción de controles positivos usando secuencias plenamente identificadas en concentraciones conocidas, para cada uno de los grupos biológicos incluidos. Sobre estos controles se llevó a cabo todo el proceso desde la extracción de ADN. Finalmente, se realizó la construcción de librerías para secuenciación, y se usó el sistema MiSeq, plataforma Illumina. En la secuenciación se incluyeron blancos además de los controles negativos de extracción y amplificación, y controles positivos. Los blancos corresponden a posos sin reactivos y sin ADN. Una vez obtenidas las secuencias estas se demultiplexaron (asignación a muestras) usando la función ngsfilter de ObiTools (Boyer et al. 2016). Se resalta que es algunas muestras (réplicas) pueden no funcionar y por lo tanto, no obtenerse ninguna secuencia. Por esta razón, se manejan varias réplicas por muestra de forma que se disminuya la probabilidad de perder (no obtener secuencias) la muestra.
Control de calidadSe incluyen controles positivos (TPOS), controles negativos de extracción (Control), controles negativos de amplificación (TNEG) y blancos (BLK). Las secuencias solo han sido asignadas a sus respectivas muestras y ningún procesamiento bioinformático adicional se ha llevado a cabo, además de este. En caso de ser usadas, deben realizarse el tratamiento con todos los filtros y pasos de depuración que requieren los datos obtenidos de secuenciación masiva de alto rendimiento y metabarcoding. Se resalta que es algunas réplicas pueden no funcionar por diferentes factores técnicos a lo largo de procedimiento. Dada esta situación, contar con varias réplicas por muestra disminuye la probabilidad de perder (no obtener secuencias) la muestra.
Metodología paso a paso 11. Selección de localidades de estudio. 2. Selección de puntos de muestreo dentro de cada localidad. 3. Toma de muestra: registro de datos del punto de muestreo, delimitación de parcela de 16 m² y toma de 16 submuestras. 4. Homogenización de la muestra de suelo. Separación de tres sub-muestras (réplica biológica) de 15 gr. cada una. 5. Almacenamiento de las submuestras en seco. Preservadas en silica gel hasta el momento de la extracción de ADN. 6. Preparación controles negativos de extracción. 7. Construcción de controles positivos. 8. Extracción de ADN usando buffer fosfato y protocolo modificado a partir de Zinger et al. 2016, Taberlet et al. 2012 y fabricante de kit de extracción (NucleoSpin Soil, Macherey-Nagel). 9. Amplificación de los marcadores 16s (bacterias), ITS (hongos), trnL (plantas) y 18S (eucariotas) para cada una de las muestras. Se realizaron tres réplicas de PCR por muestras. Se incluyeron controles negativos de PCR. 10. Etiquetado y multiplexación de muestras. 11. Construcción librerías Illumina. 12. Secuenciación 13. Demultiplexación (asignación de secuencias a muestra) de secuencias obtenidas, usando la función ngsfilter encontrada en ObiTools (Boyer et al. 2016). 14. Ubicación de los archivos: Los datos se encuentran depositados temporalmente en un disco duro externo ubicado en el Instituto Alexander von Humboldt, en la carpeta MetabarcodingBio. Dentro de esta carpeta, se ubican otras cuatro correspondientes a cada grupo biológico: Bacterias, Fungi, Eukarya y Plantae. En cada carpeta se encuentran alrededor de 630 archivos correspondientes a las réplicas por PCR de cada réplica biológica procesada por punto de muestreo. Los archivos son nombrados de acuerdo a: 1. Nombre de la muestra, 2. Número de la réplica biológica (1 / 2 / 3) y 3. Número de la réplica de PCR (a / b / c). Por ejemplo, el archivo sample:CON_S3_1a.fastq corresponde a la muestra "CON_S3", la réplica biológica "1" y la réplica de PCR "a". Bajo este marco, para cada réplica biológica se proporcionan 3 archivos. Por ejemplo, para la muestra CON_S3: sample:CON_S3_1a.fastq sample:CON_S3_1b.fastq sample:CON_S3_1c.fastq Nota 1: Es posible no contar con todas las réplicas por muestra ya que por diferentes factores a lo largo del procedimiento, la PCR o la secuenciación pueden ser inhibidas. En este caso, lo recomendable es trabajar con las réplicas generadas. Nota 2: Recuerde incluir todas las réplicas de un punto de muestreo al momento de analizar y depurar los datos.
Referencias
Identificador de la citación para este recurso http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_suelos
Cómo citar este recurso Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt (2020). Secuencias de ADN obtenidas para la Caracterización de la Biodiversidad en muestros de suelo a partir de metabarcoding. 93 eventos. http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_suelos
Referencia Taberlet, P., Bonin, A., Coissac, E., & Zinger, L. (2018). Environmental DNA: For biodiversity research and monitoring. Oxford University Press.
Referencia Zinger, L., Chave, J., Coissac, E., Iribar, A., Louisanna, E., Manzi, S., Schilling, V., Schimann, H., Sommeria-Klein, G., Taberlet, P. (2016). Extracellular DNA extraction is a fast, cheap and reliable alternative for multi-taxa surveys based on soil DNA. Soil Biology & Biochemistry 96: 16-19
Referencia Boyer, F., Mercier, C., Bonin, A., Le Bras, Y., Taberlet, P., & Coissac, E. (2016). obitools: A unix‐inspired software package for DNA metabarcoding. Molecular ecology resources, 16(1), 176-182.
Metadatos Adicionales
Nivel de jerarquíadataset
PropósitoEl objetivo de este proyecto es realizar la caracterización biótica, a través de metabarcoding, a partir de muestras de suelo, en tres diferentes páramos de Boyacá, el departamento de Colombia con mayor representatividad de páramos en el país. Con el análisis de los datos reportados, se pretende conocer el estado de la diversidad de estos páramos, en sus paisajes con diferentes niveles de intervención, para contar con una la línea base que permita analizar el impacto de las perturbaciones actuales, naturales y ocasionadas, y evaluar transformaciones futuras.