Caracterización de biodiversidad en muestras de suelo a partir de metabarcoding

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Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt (2020). Secuencias de ADN obtenidas para la Caracterización de la Biodiversidad en muestros de suelo a partir de metabarcoding. 93 eventos. http://i2d.humboldt.org.co/ceiba/resource.do?r=metabarcoding_suelos

Palabras clave

bacterias; hongos; eucariotas; plantas; páramos; alta montaña; gradiente de elevación; coberturas vegetales; otro

Contactos

Cobertura geográfica

Los datos fueron tomados en la cordillera Oriental de Colombia entre los 110 m y 3851 m de elevación. Se tomaron muestras de suelos enfocados en sistemas de alta montaña y páramos del departamento de Boyacá entre los 2298 m y 3851 m de elevación, y se incluyeron muestras de un gradiente de elevación desde los 110 metros de elevación como referencia.

Cobertura taxonómica

La generación de datos se enfocó en cuatro grupos biológicos: bacterias, hongos, plantas y eucariotas. Se reportan 2524 registros que corresponden a secuencias genéticas por réplica por grupo biológico. Específicamente, se reportan 630 registros para bacterias (Bacteria), 629 registros para hongos (Fungi), 633 registros para plantas (Plantae) y 632 registros para Eucariotas (Eukarya). El nivel taxonómico alcanzado dentro de cada grupo biológico es dependiente de la resolución y de cuán completas se encuentren las bases de referencia usadas. Los archivos asociados no se encuentran depurados ni cuentan con alguna asignación taxonómica, por lo que no es posible determinar que taxones de cada grupos se encuentran ni el número de secuencias encontrados en cada uno.

Cobertura temporal

Datos del proyecto

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Personas asociadas al proyecto:

Métodos de muestreo

Muestreo en campo: En cada punto de muestreo, se estableció una parcela de 4 m x 4 m, en donde se tomó una muestra de suelo de aproximadamente 10 cm de profundidad por cada metro. Por cada muestra homogenizada, compuesta del suelo recolectado de las 16 sub-muestras, se obtuvieron tres réplicas de 15 gr (réplicas biológicas). Todos los muestreos de suelos se realizaron con palas esterilizadas por flameo, utilizando guantes de nitrilo y tapabocas que fueron cambiados entre cada evento de recolecta. Las muestras se conservaron en seco con sílica gel hasta el momento de la extracción de ADN. Extracción de ADN: Se extrajo el ADN ambiental extracelular de cada muestra siguiendo las recomendaciones de Zinger et al. 2016 y Taberlet et al. 2012. Se utilizó un kit comercial para extracción de ADN ambiental (NucleoSpin Soil; Macherey-Nagel, Düren, Alemania), modificando el paso de lisis, usando un buffer de fosfato para realizar un lavado del ADN extracelular y siguiendo las instrucciones del fabricante. Por cada evento de extracción se incluyó un control negativo que constó de los reactivos usados sin ADN. La diversidad de bacterias, hongos, plantas y eucariotas, fue examinada a través de la técnica molecular de metabarcoding, usando los marcadores moleculares 16S (regionV3-V4), ITS, trnGH y 18S, respectivamente. Se realizaron tres amplificaciones por muestra (tres réplicas de PCR) para los cuatro marcadores mencionados. Por cada evento de amplificación, se incluyó un control negativo de PCR. Se realizó la construcción de controles positivos usando secuencias plenamente identificadas en concentraciones conocidas, para cada uno de los grupos biológicos incluidos. Sobre estos controles se llevó a cabo todo el proceso desde la extracción de ADN. Finalmente, se realizó la construcción de librerías para secuenciación, y se usó el sistema MiSeq, plataforma Illumina. En la secuenciación se incluyeron blancos además de los controles negativos de extracción y amplificación, y controles positivos. Los blancos corresponden a posos sin reactivos y sin ADN. Una vez obtenidas las secuencias estas se demultiplexaron (asignación a muestras) usando la función ngsfilter de ObiTools (Boyer et al. 2016). Se resalta que es algunas muestras (réplicas) pueden no funcionar y por lo tanto, no obtenerse ninguna secuencia. Por esta razón, se manejan varias réplicas por muestra de forma que se disminuya la probabilidad de perder (no obtener secuencias) la muestra.

Descripción de la metodología paso a paso:

1. 1. Selección de localidades de estudio. 2. Selección de puntos de muestreo dentro de cada localidad. 3. Toma de muestra: registro de datos del punto de muestreo, delimitación de parcela de 16 m² y toma de 16 submuestras. 4. Homogenización de la muestra de suelo. Separación de tres sub-muestras (réplica biológica) de 15 gr. cada una. 5. Almacenamiento de las submuestras en seco. Preservadas en silica gel hasta el momento de la extracción de ADN. 6. Preparación controles negativos de extracción. 7. Construcción de controles positivos. 8. Extracción de ADN usando buffer fosfato y protocolo modificado a partir de Zinger et al. 2016, Taberlet et al. 2012 y fabricante de kit de extracción (NucleoSpin Soil, Macherey-Nagel). 9. Amplificación de los marcadores 16s (bacterias), ITS (hongos), trnL (plantas) y 18S (eucariotas) para cada una de las muestras. Se realizaron tres réplicas de PCR por muestras. Se incluyeron controles negativos de PCR. 10. Etiquetado y multiplexación de muestras. 11. Construcción librerías Illumina. 12. Secuenciación 13. Demultiplexación (asignación de secuencias a muestra) de secuencias obtenidas, usando la función ngsfilter encontrada en ObiTools (Boyer et al. 2016). 14. Ubicación de los archivos: Los datos se encuentran depositados temporalmente en un disco duro externo ubicado en el Instituto Alexander von Humboldt, en la carpeta MetabarcodingBio. Dentro de esta carpeta, se ubican otras cuatro correspondientes a cada grupo biológico: Bacterias, Fungi, Eukarya y Plantae. En cada carpeta se encuentran alrededor de 630 archivos correspondientes a las réplicas por PCR de cada réplica biológica procesada por punto de muestreo. Los archivos son nombrados de acuerdo a: 1. Nombre de la muestra, 2. Número de la réplica biológica (1 / 2 / 3) y 3. Número de la réplica de PCR (a / b / c). Por ejemplo, el archivo sample:CON_S3_1a.fastq corresponde a la muestra "CON_S3", la réplica biológica "1" y la réplica de PCR "a". Bajo este marco, para cada réplica biológica se proporcionan 3 archivos. Por ejemplo, para la muestra CON_S3: sample:CON_S3_1a.fastq sample:CON_S3_1b.fastq sample:CON_S3_1c.fastq Nota 1: Es posible no contar con todas las réplicas por muestra ya que por diferentes factores a lo largo del procedimiento, la PCR o la secuenciación pueden ser inhibidas. En este caso, lo recomendable es trabajar con las réplicas generadas. Nota 2: Recuerde incluir todas las réplicas de un punto de muestreo al momento de analizar y depurar los datos.

Referencias bibliográficas

1. Taberlet, P., Bonin, A., Coissac, E., & Zinger, L. (2018). Environmental DNA: For biodiversity research and monitoring. Oxford University Press.
2. Zinger, L., Chave, J., Coissac, E., Iribar, A., Louisanna, E., Manzi, S., Schilling, V., Schimann, H., Sommeria-Klein, G., Taberlet, P. (2016). Extracellular DNA extraction is a fast, cheap and reliable alternative for multi-taxa surveys based on soil DNA. Soil Biology & Biochemistry 96: 16-19
3. Boyer, F., Mercier, C., Bonin, A., Le Bras, Y., Taberlet, P., & Coissac, E. (2016). obitools: A unix‐inspired software package for DNA metabarcoding. Molecular ecology resources, 16(1), 176-182.

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